囊胚怎么算怀孕多少天&嘉宝助孕&ERRα拮抗剂Compound 29抑制破骨细胞改善肥胖引起

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本文作者：钟丽红1,2卢兆成1,3黄童龄1,2杨萌1,2段锐3管敏1*

1中国科学院深圳先进技术研究院

2中国科学院大学

3华南师范大学体育科学学院

肥胖与骨科疾病密切相关，笔者从骨丢失的影响因素方面撰写了本文，通过高脂饮食（HFD）诱导肥胖雄鼠模型，发现肥胖小鼠中破骨吸收异常，骨量减少。ERRα拮抗剂Compound29抑制ERRα的活性后，肥胖小鼠的破骨吸收减弱，骨量流失减缓，同时糖耐受能力提高。因此，ERRα拮抗剂Compound29改善HFD诱导的肥胖雄鼠的骨丢失。

钟丽红,卢兆成,黄童龄,等.ERRα拮抗剂Compound29抑制破骨细胞改善肥胖引起的骨丢失[J].生物骨科材料与临床研究,2021,18(3):24-29.

目的在高脂饮食（HFD）诱导的肥胖雄鼠中探究雌激素相关受体alpha（ERRα）拮抗剂Compound29对小鼠骨量的改善作用。方法C57BL/6J雄鼠随机分为HFD组、“HFD+Compound29”组（“HFD+C29”组）和普通饮食组（CD组），每组各6只。在整个实验过程中，HFD组和“HFD+C29”组小鼠用高脂饲料喂养，CD组小鼠用普通饲料喂养。喂养18周后，“HFD+C29”组小鼠每天Compound29灌胃给药，CD组和HFD组小鼠等量溶剂灌胃，持续3周。最后进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）并处死小鼠收集样品。用微计算机断层扫描技术对右股骨进行骨组织形态学分析，左股骨石蜡包埋切片后分别进行苏木素伊红（HE）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，用酶联免疫吸附测定法检测血浆I型胶原交联羧基末端肽（CTX-I）浓度。

结果骨扫描和HE染色结果显示与CD组相比，HFD组小鼠骨密度、骨小梁数量和厚度减少，HFD组小鼠发生骨量丢失；Compound29给药后，HFD小鼠骨密度和骨量得到明显改善。TRAP染色和CTX-I浓度检测结果表明Compound29给药后，HFD小鼠破骨细胞数量减少，骨吸收减弱。此外，OGTT结果显示Compound29提高HFD小鼠糖耐受能力。结论ERRα拮抗剂Compound29改善HFD诱导的肥胖雄鼠的骨丢失。

Compound29；雌激素相关受体alpha；代谢；破骨细胞；骨丢失

骨是不断重塑的动态器官，受成骨细胞和破骨细胞的分化和活性调节。成骨细胞由间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）分化而来，通过分泌胶原蛋白和非胶原蛋白组成类骨质，并进一步钙化形成新骨；破骨细胞由造血干细胞分化而来，通过溶解骨基质中的有机成分和无机成分发挥骨吸收功能。成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的精细平衡构成了骨稳态，骨稳态失衡则可能导致骨质疏松、骨关节炎等常见退行性骨病[1-2]。

肥胖与骨科疾病密切相关，在一项包含成年男性、绝经前和绝经后女性的研究中表明，体脂比例与骨质疏松和非脊柱性骨折发生率呈正相关[3]。临床数据表明超重或患有肥胖症儿童的骨量低于正常体重儿童[4]，骨折概率高于正常体重儿童[5]，超重或患有肥胖症成年男性的骨量与体重呈负相关[6]。此外，动物研究还发现，高脂饮食（high-fatdiet，HFD）引起的肥胖伴随着过度的骨吸收[7]。肥胖诱导促炎因子TNF-α表达增加，并通过其下游信号通路促进破骨分化相关基因的转录，对破骨形成有激活作用[8-9]；肥胖亦增加核因子κB受体活化因子配体（receptoractivatorofNF-κBligand，RANKL）/骨保护素的比率，促进破骨细胞分化[10]。

雌激素相关受体（Estrogen-relatedreceptoralpha，ERRα）属于核受体超家族，是一种孤儿核激素受体，参与调节线粒体的活性、生物发生和更新，以及脂质分解代谢，在细胞能量代谢中发挥核心作用，是代谢紊乱调节的潜在靶标[11-12]。研究发现，ERRα全身性敲除小鼠中可抵抗高脂饮食（HFD）诱导的肥胖[13]，进一步研究发现缺失ERRα基因影响了小肠的脂吸收和脂转运[14]。此外，ERRα作为线粒体的关键代谢调控因子，还调节破骨分化过程中的能量代谢。研究表明，Myc是破骨细胞分化的关键决定因素，髓系细胞特异性敲除Myc小鼠的破骨细胞生成减少，通过代谢学分析和ChIP分析发现，Myc直接转录调控ERRα介导代谢适应，通过调节不同的代谢基因影响破骨细胞分化，表明Myc/ERRα通路是破骨细胞氧化代谢的重要调控通路[15]。另一项研究则发现破骨分化过程中，ERRα与共激活因子PGC-1β转录调节Ndg2、IDH3a、ATP5b和MCAD等基因表达，促进线粒体三羧酸循环并增强线粒体的OXPHOS，证明了ERRα通过调控代谢通路影响破骨分化的重要作用[16]。此外，还有研究报道胆固醇可能是ERRα内源性配体，激活ERRα下游氧化代谢相关通路促进破骨形成，进一步用ERRα拮抗剂XCT790则抑制胆固醇诱导的破骨分化[17]。以上研究表明作为线粒体的关键调控因子ERRα介导破骨细胞分化过程中的代谢适应，提示靶向ERRα的特异性小分子拮抗剂可抑制破骨形成，ERRα是潜在的骨质疏松治疗靶点。

糖脂代谢紊乱与骨疾病密切相关，骨质疏松症被认为是糖尿病或肥胖症并发症之一。HFD引起的肥胖伴随着过度的骨吸收，ERRα是骨质疏松治疗的潜在靶标。基于此，笔者构建长期HFD诱导的肥胖小鼠模型，对小鼠进行雌激素相关受体ERRα拮抗剂Compound29灌胃给药，探究Compound29对肥胖小鼠骨量的改善作用。

1.1材料

1.1.1动物

从北京维通利华实验动物技术有限公司购进18只健康的5周龄C57BL/6J雄鼠，每笼6只，饲养于中国科学院深圳先进技术研究院实验室动物中心。SPF房间室温保持24℃，每隔12h光暗循环，并按照实验要求分别用高脂饲料（ResearchDietsD12492，60kcal%Fat）或普通饲料饲养，自由摄食与饮水。

1.1.2主要试剂与仪器

Compound29（CEA665Mu，Cloud-Clonecorp公司，美国）、血糖仪及血糖试纸（C0105S，碧云天生物技术公司，上海）、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistantacidphosphatase，TRAP）染色试剂盒（表示“HFD+C29”组与HFD组比较，；表示“HFD+C29”组与HFD组比较，；表示“HFD+C29”组与HFD组比较，；表示“HFD+C29”组与HFD组比较，。

2.4ERRα拮抗剂Compound29抑制肥胖小鼠的破骨吸收

将小鼠的左股骨用石蜡包埋切片，并进行HE染色和TRAP染色。小鼠股骨远心端HE染色切片显示，HFD组与CD组小鼠的骨小梁差异明显。CD组小鼠骨小梁数量多且较粗，HFD组小鼠骨小梁数量少且较细，并伴随大量脂肪空泡，而“HFD+C29”组小鼠骨量显著高于HFD组，且脂肪空泡减少（见图4A）。TRAP是破骨细胞特异性酶，染色后破骨细胞呈红色。骨切片经TRAP染色后用ImageJ进行破骨细胞计数及骨吸收情况分析，结果显示与CD组小鼠相比，HFD组小鼠单位骨小梁周长破骨细胞数（/）增加，破骨细胞周长百分率（/）升高，Compound29给药后，/减少，/下降（见图4B-D）。

图4Compound29对HFD小鼠破骨吸收的影响：A.各组小鼠股骨切片远心端HE染色（比例尺：100μm）；染色（比例尺：100μm），破骨细胞呈红色；C、D.骨吸收参数分析：单位骨小梁周长破骨细胞数（/）（C）和破骨细胞周长百分率（/）（D）

注：*表示HFD组与CD组比较，；**表示HFD组与CD组比较，；表示“HFD+C29”组与HFD组比较，。

Compound29是针对ERRα与PGC1的共激活结构域开发的ERRα选择性拮抗剂，TR-FRET实验显示Compound29高效抑制ERRα活性（IC50=0.04μM），但是对同一家族的ERRγ的抑制效用却很低[18]，因此，与传统的ERRα拮抗剂XCT790相比，Compound29具有更特异的靶向性和较好药物安全性，适合用于体内实验[18]。笔者用Compound29对肥胖小鼠进行灌胃给药，结果显示肥胖小鼠破骨细胞数量减少，骨吸收减弱，同时骨密度与骨小梁数量和厚度增加，表明Compound29有效保护肥胖小鼠骨量。骨切片的HE染色和TRAP染色显示HFD诱导的肥胖小鼠骨髓腔中有大量的脂肪空泡，而Compound29给药后脂肪空泡减少，表明Compound29给药后减少骨髓脂肪细胞的累积。此外，有研究表明Compound29是一种潜在的降糖化合物[18]，笔者的实验结果发现Compound29灌胃给药后，肥胖小鼠血糖水平下降，糖耐受能力提高。这些研究提示Compound29不仅直接作用于破骨形成，也可能通过调控小鼠的糖脂代谢间接改善骨稳态失衡。

ERRα在骨形成中的作用尚存在争议：一方面，有研究发现大鼠颅盖成骨细胞分化过程中ERRα始终高表达，体外抑制ERRα的表达颅盖成骨细胞分化减弱[19]，同样，ERRα全身性敲除小鼠中分离的MSCs体外成骨分化能力减弱[20]；另一方面，也有研究发现ERRα缺失后小鼠的骨形成增强，股骨骨量增加，能抵抗衰老和雌激素缺乏导致的骨丢失[21]，这些研究表明ERRα的骨形成作用，笔者的研究证实Compound29给药显著抑制肥胖小鼠破骨吸收，Compound29是否通过破骨吸收或脂肪因子间接影响骨形成，或是直接作用于成骨细胞值得进一步探索。

综上，本研究通过HFD诱导肥胖雄鼠模型并发现ERRα拮抗剂Compound29通过抑制破骨吸收，改善肥胖雄鼠的骨丢失，为代谢紊乱引起的骨质疏松治疗提供依据，同时本研究证实了Compound29抑制破骨吸收的作用，对骨质疏松靶点药物的研发有一定的参考价值。

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